Tujuh gen untuk Saccharomyces cerevisiae telah diidentifikasi (Lertwattanasakul et al., 2007). ScADH1 mengkode enzim fermentatif yang memproduksi etanol (Bennetzen dan Hall, 1982). ScADH1 diekspresikan dalam jumlah banyak dengan kehadiran glukosa. ScADH2 mengkode isozim yang mengubah etanol menjadi asetaldehid (Ciriacy, 1975; Wills dan Jornvall, 1979; serta Russel dan Hall, 1983). ScADH2 diregulasi secara negatif dengan kehadiran glukosa. Gen ScADH3 ditekan jumlahnya degnan kehadiran glukosa dan protein pada mitokondria (Young dan Pilgrim, 1985). ScADH4, ScADH5, and ScADH6 mengkode protein ScADH4, ScADH5, and ScADH6. ScADH6 and ScADH7 diduga berkontribusi dalam menyeimbangkan jumlah NADP+/NADPH (Larroy et al., 2002).
Tabel 1. Variasi Alkohol Dehidrogenase Pada Manusia
| Kelas | Nama Resmi Gen | Nama Lama | Nama Lain | Urutan | Protein |
| I | ADH1A | ADH1 | ADH1A | NM_000667 | α |
| I | ADH1B | ADH2 | ADH1B | NM_000668 | β |
| I | ADH1C | ADH3 | ADH1C | NM_000669 | γ |
| II | ADH4 | ADH4 | ADH2 | NM_000670 | π |
| III | ADH5 | ADH5 | ADH3 | NM_000671 | χ |
| V | ADH6 | ADH6 | ADH5 | NM_000672 | ADH6 |
| IV | ADH7 | ADH7 | ADH4 | NM_000673 | σ |
Adanya variasi jenis ADH menyebabkan bervariasinya laju metabolisme alkohol di dalam hati. Berdasarkan properti kinetik inilah maka kemampuan hati seseorang dalam mengoksidasi alkohol dapat diamati. Aktivitas alkohol dehidrogenase akan bervariasi antara pria dan wanita, tua dan muda, serta kondisi lingkungan (Edenberg, 2007).
Isolasi
a) Mengisolasi ADH dari Hati Manusia atau Hewan
2-5 gram hati manusia yang telah meninggal (±12 jam) dihomogenisasi dalam 2-5 mL natrium fosfat 50 mM (pH 7,5) pada suhu 4°C. Homogenat kemudian disentrifugasi selama 60 menit dengan kecepatan 10.000 x g. Supernatan kemudian digunakan untuk karakterisasi.
b) Mengisolasi ADH dari Bakteri
1) Cloning Gen Pengkode Alkohol Dehidrogenase
Urutan basa nitrogen pengkode alkohol dehidrogenase (adhD) disesuaikan dengan basis data yang telah ada. Gen tersebut kemudian diperbanyak dengan menggunakan PCR dengan primer yang sesuai. Gen-gen yang telah diperbanyak kemudian dimurnikan dan dipotong dengan menggunakan enzim restriksi. Potongan ini kemudian disambungkan dengan vektor kemudian diinsersikan ke dalam sel inang (E.coli) untuk diperbanyak. Kemudian vektor hasil perbanyakan melalui kloning diisolasi kemudian ditempelkan pada vektor ekspresi untuk kemudia ditransformasikan ke dalam sel inang. (Machielsen, 2006)
2) Produksi dan Pemurnian
Sel inang yang mengandung vektor ekspresi kemudian diinokulasi ke dalam media LB cair. Sel diinkubasi overnight pada shaker. Kemudian dilakukan scale-up sehingga diperoleh kultur dalam jumlah yang lebih besar. Kultur di-induce dengan menggunakan IPTG, kemudian diinkubasi kembali. Sel kemudian dipanen, dilarutkan kembali dengan menggunakan Tris-HCl buffer dan diberi tekanan. Crude extract kemudian disentrifugasi selama ±20 menit dengan kecepatan 10,000 x g. Supernatan yang dihasilkan digunakan untuk karakterisasi. Proses pemurnian dapat dilakukan menggunakan metode kolom kromatografi (Machielsen, 2006)
c) Mengisolasi ADH dari Ragi
Sel ragi sebanyak ±100dian ditambahkan 2mM β-mercaptoetanol, dan glass beads. Sel dihancurkan dengan menggunakan vortex. Sampel kemudian disentrifugasi selama ±10 menit dengan kecepatan 12,000 rpm. Supernatant kemudian digunakan untuk proses karakterisasi (Zanon, 2006).
0 Komentar untuk "Regulasi Gen dan Isolasi Enzim ADH"
Berkomentarlah dengan baik dan sopan, saya akan berusaha untuk menjawab setiap pertanyaan dan menanggapi setiap komentar yang anda berikan, :)
Terimakasih atas kunjungan dan komentarnya :)